Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Patologia Ambiental e Experimental

Dissertações Defendidas - 2013

Título: Caracterização Fenotípica e Genotípica de Malassezia spp. Isoladas de Conduto Auditivo Externo de Equinos
Autor(a): Ana Lúcia Aldrovandi
Orientador(a): Selene Dall'Acqua Coutinho
Data da defesa: 01/02/2013
Resumo:  O presente estudo teve como objetivo identificar espécies do gênero Malassezia isoladas do conduto auditivo externo de equinos, através de provas fenotípicas e genotípicas. Foram utilizados 55 animais sadios, 39 (70,9%) machos e 16 (29,1%) fêmeas, de diferentes raças e idade adulta, os quais foram contidos fisicamente. Após limpeza do pavilhão auricular, foi colhido cerúmen de cada conduto, pela introdução de um swab estéril. As amostras clínicas (107, pois 03 delas foram descartadas, devido contaminação) foram enviadas ao Laboratório de Biologia Molecular e Celular da Universidade Paulista (UNIP), onde foram semeadas em placas contendo meio de Dixon modificado, as quais permaneceram incubadas a 32°C por até duas semanas, a fim de se detectar o crescimento de colônias. As colônias isoladas foram estudadas macro e micromorfologicamente, para se confirmar a morfologia característica do gênero. A identificação fenotípica em espécies foi baseada em aspectos fisiológicos da levedura, verificando seu comportamento frente a diferentes fontes de lipídios, sendo empregados Tween 20, 40, 60 e 80, e cremophor-EL, testando-se ainda, produção da enzima catalase e degradação de esculina. Malassezia sp foi isolada em 33/55 (60,0%) dos animais e em 52/107 (48,6%) dos condutos. Nos testes fenotípicos, nenhuma das cepas cresceu em ágar Sabouraud dextrose, sendo, portanto, lipodependentes. Todas as cepas produziram a enzima catalase e degradaram esculina. Verificou-se assimilação de Tween 20, 40, 60 e 80, ausência de assimilação de cremophor-EL em 37/52 (71,2%) das cepas isoladas; as outras 15 cepas apresentaram diferentes padrões de leitura, entretanto, nenhum dos resultados obtidos possibilitou caracterização fenotípica em espécie. Após extração do DNA, através de fervura durante 10 minutos, as amostras foram submetidas à técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) e, posteriormente, à técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) nos produtos obtidos da PCR, utilizando-se as enzimas de restrição BstCI e HhaI, caracterizando-se molecularmente M. nana 42/52 (80,8%) e M. slooffiae 10/52 (19,2%). Duas cepas de cada uma das espécies foram encaminhadas para sequenciamento genético. A análise do sequenciamento da região dos genes 26S rRNA D1/D2 e ITS1-5.8S-ITS2 rRNA das quatro cepas analisadas confirmou, molecularmente, duas cepas como sendo M. nana e as outras duas como M. slooffiae. Neste estudo, M. nana foi a principal espécie do gênero Malassezia encontrada em conduto auditivo externo de equinos, representando mais de 80% das cepas, não se isolando M. equina, como seria esperado. Portanto, novos levantamentos epidemiológicos devem ser realizados em diferentes regiões, a fim de se confirmar este achado. Conclui-se que a caracterização genética é imprescindível em estudos com amostras clínicas provenientes de equinos e evidencia-se a necessidade de se ampliar pesquisas que possibilitem maior compreensão do encontro dessas leveduras lipodependentes, e as espécies constituintes da microbiota, uma vez que, em outras espécies animais, já está demonstrado que Malassezia spp. podem se constituir em importantes agentes etiológicos de infecções micóticas.

Palavras-chave: Malassezia; equinos; microbiota; conduto auditivo externo.
Área de Concentração: Patologia Ambiental e Experimental
Linha de Pesquisa: Pesquisa de Malassezia spp. em conduto auditivo externo e pelame de equinos sadios
Grupo de Pesquisa da UNIP cadastrado no CNPq: Clininfec - Clínica e doenças infecciosas veterinárias


Título: Salmonella spp. e E. coli patogênica isoladas de animais selvagens de vida livre e sua sensibilidade a antimicrobianos
Autor(a): Renata de Oliveira Iovine
Orientador(a): Vania Maria de Carvalho
Data da defesa: 18/02/2013
Resumo: Medicina da Conservação (One world, One health) é a área da ciência que compreende o estudo das doenças que resultam da interação entre o homem, animais e meio ambiente. Dentre as bactérias com potencial zoonótico encontram-se Escherichia coli e Salmonella spp., empregadas também como medidas de contaminação ambiental e/ou ação antrópica. O objetivo deste trabalho foi a pesquisa de E. coli patogênicas e Salmonella spp., e sua resistência a antibacterianos, em mamíferos selvagens capturados em quatro diferentes áreas naturais brasileiras. Foram coletados swabs retais de 66 animais de diferentes espécies, processados segundo protocolos já estabelecidos para o isolamento de E. coli e Salmonella. As cepas foram analisadas quanto à resistência a antimicrobianos de acordo com padronização internacional. Para as E. coli, foram pesquisados, por meio de PCR, genes referentes às cepas diarreiogênicas, ExPEC e grupos filogenéticos.  Foram isoladas quatro cepas de Salmonella enterica, sorotipos 60:r:e,n,z15, Belem, Newport e Carrau, sendo este último multirresistente. Oitenta e seis cepas de E. coli foram isoladas e as provenientes de animais do Parque Estadual da Cantareira (São Paulo) apresentaram pelo menos um dos genes pesquisados; 51,5% e 35,0% dos isolados dos animais, respectivamente, de Nhecolândia (Pantanal) e Parque Estadual da Serra da Tiririca/Reserva Ecológica Darcy Ribeiro (Rio de Janeiro), não apresentaram os genes pesquisados, sendo 20 o percentual de cepas negativas em Santa Isabel do Rio Negro (Amazônia). O grupo filogenético B1 foi prevalente entre os isolados (42,0%). Acima de 50,0% das cepas isoladas de todos os locais foram resistentes a antimicrobianos, especialmente β-lactâmicos, sendo que quatro cepas de E. coli obtidas de animais do Parque Estadual da Cantareira, local com alta ação antrópica, apresentaram multirresistência. A intensa ação humana pode levar à contaminação ambiental por cepas resistentes e/ou com potencial patogênico que, por sua vez, podem ser transmitidas para os animais selvagens.

Palavras-chave: Salmonella; E. coli; Animais Selvagens.
Área de Concentração:
Patologia Ambiental e Experimental
Linha de Pesquisa: Avaliação Imunopatológica das Enfermidades Infecciosas e Parasitárias
Grupo de Pesquisa da UNIP cadastrado no CNPq: Clininfec - Clínica e doenças infecciosas veterinárias


Título: Reanálise da migração e da diferenciação de células B-1 no foco inflamatório agudo
Autor(a): Tatiana Mara Monteiro Paixão
Orientador(a): Mario Mariano
Data da defesa: 22/02/2013
Resumo: As células B-1 são encontradas predominantemente nas cavidades pleural e peritoneal de camundongos. Sua origem e função ainda não são completamente conhecidas. Elas apresentam marcadores de superfície de linhagens mieloide e linfoide e migram para focos inflamatórios, comportando-se como células fagocíticas.
As reavaliações desses fenômenos, tanto a migração quanto a diferenciação, foram os objetivos deste trabalho. Para isso, foram utilizados camundongos das linhagens BALB/c e BALB/xid. Estes, imunodeficientes em linfócitos B-1, receberam essas células marcadas com CFSE por transferência intraperitoneal adotiva.
Lamínulas circulares de vidro foram implantadas no tecido subcutâneo dos animais para a formação de um foco inflamatório agudo inespecífico. Após diferentes tempos, os camundongos foram sacrificados e os implantes removidos. As células aderentes nas lamínulas, obtidas por raspagem, receberam anticorpos para marcação das seguintes moléculas de superfície: CD19, CD23, CD11b e F4/80. Foram então analisadas em citômetro de fluxo.
Os resultados mostram que células B-1(CD19+CD23- CD11b+) migram para o foco inflamatório induzido sendo detectadas após 6, 24 e 48 horas do implante das lamínulas em camundongos BALB/c e em 48 horas após, em animais xid com células transferidas. O aumento da expressão de F4/80 em células CD19+ sugere o início de diferenciação de B-1 em fagócitos mononucleares.
Os dados demonstraram que células B-1 migram da cavidade peritoneal para um foco inflamatório agudo inespecífico e se diferenciam  em células fagocíticas.

Palavras-chave: Célula B-1. Migração. Diferenciação. Inflamação
Área de Concentração: Patologia Ambiental e Experimental
Linha de Pesquisa: Modelos Experimentais em Patologia e Toxicologia
Grupo de Pesquisa da UNIP cadastrado no CNPq: Clininfec - Clínica e doenças infecciosas veterinárias


Título: Avaliação de uma formulação de micro e nanocápsulas poliméricas contendo porfirina para Terapia Fotodinâmica (TFD) em sistemas biológicos
Autor(a): Andreza Pereira dos Santos
Orientador(a): Lúcia Jamli Abel
Data da defesa: 27/02/2013
Resumo: A Terapia Fotodinâmica (TFD) envolve a ativação de substâncias fotossensíveis com uma fonte de luz, promovendo a formação de espécies reativas de oxigênio e de radicais livres visando à destruição dos tecidos alvos. A TFD apresenta resultados satisfatórios para o tratamento do câncer sob o ponto de vista médico, sendo viável para tratamento de doenças como psoríase, vitiligo e melanoma. Estudos sobre novos compostos e entender os mecanismos de ação dos agentes fotossensíveis tornam-se imperativos para obtenção de melhores resultados clínicos.
O presente trabalho teve como objetivo analisar e comparar o efeito de uma formulação micro e nanoencapsulada contendo porfirina 3MMe em linhagens de fibroblastos NIH 3T3, melanoma murino B16-F10 e melanócito Melan-A in vitro por meio de indicadores de função e viabilidade celular. Avaliou-se, ainda, o efeito da formulação micro e nanoencapsulada contendo porfirina 3MMe em modelos experimentais de melanoma murino in vivo. Os resultados mostraram que a citotoxicidade celular foi diretamente proporcional à concentração de porfirina 3MMe e tempo de incubação e irradiação, sendo o tratamento significativamente mais efetivo para as células da linhagem B16-F10 em relação às células da linhagem 3T3 e Melan-A. Não foi observada citotoxicidade celular na presença de porfirina 3MMe na ausência de luz (grupo controle), comprovando a ação fotodinâmica da formulação.
Estudos in vivo mostraram que os animais com melanoma, que receberam a porfirina e foram irradiados apresentaram diminuição significativa da massa tumoral em relação aos demais grupos controle, com presença de focos hemorrágicos e erosão associados à presença de necrose da epiderme, indicando ação fotodinâmica da porfirina 3MMe.
De acordo com os resultados, a formulação de micro e nanocápsulas poliméricas contendo porfirina 3MMe apresentou efeitos citotóxicos in vitro e in vivo, com potencial terapêutico e promissor no tratamento de melanoma pela TFD.

Palavras-chave: Melanoma; Fotossensibilizador; Terapia Fotodinâmica; Porfirinas.
Área de Concentração:
Patologia Ambiental e Experimental
Linha de Pesquisa: Modelos Experimentais em Patologia e Toxicologia
Grupo de Pesquisa da UNIP cadastrado no CNPq: Clininfec - Clínica e doenças infecciosas veterinárias


Título: Modulação da resposta inflamatória por preparações homeopáticas de Timulina e Antimonium crudum na leishmaniose experimental murina
Autor(a): Fabiana Rodrigues de Santana
Orientador(a): Leoni Villano Bonamin
Data da defesa: 28/02/2013
Resumo: A leishmaniose é uma zoonose causada por protozoários intracelulares do sistema fagocítico mononuclear. A modulação da atividade dessas células pode impactar a relação hospedeiro/parasita e o prognóstico da doença. O presente trabalho avaliou a atividade dos medicamentos homeopáticos Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH na infecção experimental por Leishmania (L.) amazonensis. Camundongos Balb/c, machos, foram inoculados com 2x106 promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis no coxim plantar e, após 60 dias, foi feita a análise de citometria de fluxo das células do lavado peritoneal e do baço, além da colheita da pata com lesão, do linfonodo local e do baço, para análise histológica. Camundongos tratados com Timulina 5 cH apresentaram aumento de células B-1 no peritônio e baço (X2, p=0.0001). Além disso, observando-se as lesões plantares coradas pelo método Giemsa, a quantidade de formas amastigotas diminuiu nos animais tratados com Timulina 5 cH. No grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH houve redução da resposta inflamatória local, evidenciada histologicamente, sem alteração no número de parasitas na lesão. A imuno-histoquímica seguida de histometria do coxim plantar evidenciou redução de células CD3+, C45RA+ e CD11b+ nesses animais. Portanto, os medicamentos homeopáticos Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH alteram o perfil de células inflamatórias envolvidas na resposta cutânea à Leishmania sp., interferindo na relação hospedeiro/parasita por mecanismos distintos, ora modulando a resposta imune, ora reduzindo a inflamação local e os sintomas da doença

Palavras-chave: Leishmania (L.) amazonensis; Timulina; Antimonium crudum; Homeopatia; Modelo Experimental.
Área de Concentração: Patologia Ambiental e Experimental
Linha de Pesquisa: Patogenia das Enfermidades Infecciosas e Parasitárias
Grupo de Pesquisa da UNIP cadastrado no CNPq: Clininfec - Clínica e doenças infecciosas veterinárias


Título: Avaliação de extratos vegetais bioativos de plantas amazônicas sobre a concentração de testosterona sérica em camundongos pós-púberes
Autor(a): Paula Andreotti Rodrigues
Orientador(a): Ivana Barbosa Suffredini
Data da defesa: 28/02/2013
Resumo: Extratos vegetais antitumorais e antibacterianos obtidos das espécies Amphirrhox longifolia (Violaceae), Abarema auriculata, Pentaclethra macroloba e Swartzia sericea var. sericea (Fabaceae), Xylopia aromatica (Annonaceae), Symphonia globulifera e Moronobea coccinea (Clusiaceae), Picrolemma sprucei (Simaroubaceae), Laetia suaveolens (Salicaceae) e Ipomoea alba foram previamente avaliados quanto à toxicidade e quanto à influência sobre ansiedade e locomoção. No presente estudo, os mesmos extratos foram avaliados quanto à influência sobre a concentração de testosterona sérica em camundongos machos adultos. Grupos teste de 12 animais foram usados para testar cada um dos extratos e grupos de 12 animais controle negativo (veículo usado para suspender os extratos foi óleo de amêndoas) e positivo (testosteronai administrada por via oral e intraperitoneal (V.O. e I.P)). Doses correspondentes a 10% da dose não letal (dado obtido em trabalhos anteriores de nosso grupo) de cada extrato foram administradas V.O., por seis dias consecutivos, com descanso no sétimo dia. Seis animais de cada grupo foram eutanasiados no 22º dia de tratamento, e o peso corporal e dos testículos/epidídimo foram obtidos, como o sangue foi retirado para a quantificação hormonal em kits ELISA. Os seis animais remanescentes permaneceram por mais 23 dias sem receber os tratamentos e, no 45º dia, foram pesados, eutanasiados, os testículos+epidídimo foram retirados e pesados e o sangue retirado para se medir a quantidade de testosterona sérica. Os extratos antitumorais e antibacterianos testados, identificados como EB149, EB284, EB689, EB719, EB827, EB1097, EB1151, EB1257, EB1493 e EB1765, interferiram na concentração sérica de testosterona em camundongos pós-púberes. O peso corpóreo dos camundongos tratados com os extratos EB817, EB1097, EB1257, EB1493 e EB1765 apresentou-se alterado em relação aos dos grupos controle; por esse motivo, ao analisar o ganho de peso no período de tratamento, observou-se que apenas os camundongos tratados com os extratos EB149 e EB689 apresentaram alterações em relação aos animais dos grupos controle. Por fim, camundongos tratados com os extratos EB827, EB1257 e EB1765 apresentaram testículos+epidídimo (pesados em conjunto) com peso mais elevado, em relação aos camundongos dos grupos controle.

Palavras-chave: extratos vegetais; testosterona; toxicidade; hormônios.
Área de Concentração: Patologia Ambiental e Experimental
Linha de Pesquisa: Modelos Experimentais em Patologia e Toxicologia
Grupo de Pesquisa da UNIP cadastrado no CNPq: Toxicologia do sistema nervoso central